一、呼吸道病原学检测标本的采集方法
病原学检测标本的采集方法可分为非侵入性和侵入性,前者创伤小，患者易于接受，但容易受到上呼吸道定植菌群的污染；后者为有创性操作，从生理状态下"相对无菌"的部位取材，对诊断意义更大，其中组织活检标本是诊断肺部感染性疾病的金标准。应根据患者的临床情况选择最有效的采集方法，首先选择非侵入性方法（无创或微创检查），在非侵入性方法不能确诊时，在高度疑诊的情况下选择有创检查方法。应对标本采集者进行培训，并对所采集的标本进行质量控制，以提高标本的质量，减少假阳性和假阴性结果。呼吸道病原学标本的采集方法见表1[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。
二、标本的运送、储存与预处理
1．标本运送和储存原则：
（1）标本标签准确且申请单信息完整，应将标签贴在容器上，而非容器盖上[13,14]；（2）严格无菌操作[7]；（3）尽快送检标本，应在采样后2h内送达实验室，样本量少的标本应于30min内送检，避免标本干涸[7,15]；（4）对一些特定的病原体，应选择合适的方法对标本进行保存和运送，并及时进行检测。不同病原体检测标本的采集和转运原则见表2，不同类型标本采集量、保存和转运时间见表3。
2．针对不同病原体的检测方法：
标本采集后应及时进行质量控制，合格的标本应尽可能短期内送检。在临床工作中，除了常规检验外，还应结合患者的病史、临床表现、化验结果和影像学检查，有针对性地选择合适的检测方法对某些病原体进行检测。当临床预期和检测结果不相符时，应注意排除标本保存不当和检测方法选择错误等方面的因素。某些特殊病原体标本的转运、保存和检测方法见表4。
三、呼吸道病原检测方法的优缺点
不同检验方法的优缺点见表5[16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29]。在病原体培养和分离之后，对其进行体外药敏试验有助于进行针对性抗感染治疗。目前测定药物敏感度的方法主要有传统的药敏试验、自动化检测方法和分子生物学方法[30]。传统的药敏试验方法是表型体外试验，可直接测量细菌对抗菌药物的敏感度。自动化检测技术是在抗菌药物存在的情况下对细菌生长进行光学测定，通量高，比传统方法更加快速。也可以利用PCR等分子生物学方法直接对耐药基因进行检测，由于大多数细菌的耐药机制与多种因素相关，其基因型与表型通常并不完全相同，选择抗菌药物需综合分析决策。
四、病原检测结果的判读及其临床价值
病原学检查结果对临床治疗策略的选择具有指导意义，阴性结果有助于判断是否停用抗菌药物。病原学检查结果的判读应该综合考虑患者的年龄、基础疾病、免疫状态、临床特点、病情严重程度以及先期的抗感染治疗等情况。
（一）直接抗原快速检测
（二）血清特异性抗体检测
（三）涂片
所获取的各种标本均应行病原学涂片检查。非侵入性检查获得的标本必须为合格标本，不合格标本常存在上呼吸道定植菌污染。在结果判读时，需要结合患者的临床症状和影像学表现，排除操作过程或环境污染的可能。BALF离心沉淀后行六胺银染色、抗酸染色和革兰染色可分别用来检测肺孢子菌、分枝杆菌和部分细菌等。肺穿刺标本和胸腔积液涂片发现病原体对确诊具有重要意义。
1．细菌：
2．分枝杆菌：
痰涂片萋-尼抗酸染色和荧光染色法是诊断开放性肺结核的主要手段，但涂片镜检所见的抗酸杆菌并不能区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，荧光涂片镜检的敏感度高于萋-尼染色[44]。
3．真菌：
4．寄生虫：
涂片镜检发现寄生虫虫体、虫卵、滋养体、包囊或卵囊可作为确诊依据。直接涂片镜检可发现并殖吸虫虫卵、阿米巴原虫滋养体，吉姆萨染色可发现刚地弓形虫滋养体或包囊，改良抗酸染色可发现隐孢子虫卵囊，改良三色染色法可发现比氏微孢子虫[13,47]。
（四）培养
在进行痰培养前必须确定是合格痰标本，并排除操作不当或环境污染的情况。定量培养有助于区分致病菌和定植菌。
1．细菌：
（1）痰定量培养的细菌浓度≥cfu/ml、经气管内吸取物细菌培养浓度≥cfu/ml、BALF培养细菌浓度≥cfu/ml或保护性毛刷标本细菌培养浓度≥cfu/ml时，致病菌的可能性较大[48,49,50]；（2）胸腔积液、肺活检标本培养到病原菌[13]，下呼吸道标本培养出支气管炎博德特菌、土拉热弗朗西斯菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽胞杆菌可作为确诊依据[37]。
2．分枝杆菌：
培养结果可鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，并有利于体外药敏试验。但结核分枝杆菌培养耗时长、操作复杂，对实验室生物安全要求较高，应结合核酸检测如GeneXpert检测结果进行判断[44,51]。
3．非典型病原体：
下呼吸道标本分离培养阳性可以确诊，但耗时长，阳性率偏低，通常通过血清特异性抗体、核酸检测等方法诊断。
4．呼吸道病*：
标本进行细胞培养时出现细胞病变效应或培养细胞表面出现血细胞凝集抗原提示病*阳性。但因其培养耗时长，阳性率偏低，不建议常规应用，多通过血清特异性抗体、核酸检测等方法诊断[36]。
5．真菌：
（五）核酸分子扩增检测和基因芯片检测
与传统方法相比较，核酸分子扩增和基因芯片检测具有以下优势：（1）方法简单、快速、高效，敏感度和特异度均较高，能为临床早期诊断提供依据，尤其对一些需要长时间培养（如结核分枝杆菌）或无法体外培养（如病*）的病原体，更适合采用分子诊断技术进行检测。在新近发生的新型冠状病*肺炎疫情中，实时荧光RT-PCR检测新型冠状病*核酸阳性已经作为确诊病例的病原学诊断标准之一[35,54]。（2）目前的分子诊断技术可以一次性检测多种病原体，有助于快速筛查病原。（3）目前研发的耐药基因检测有助于制定临床决策[55,56,57]。
但分子检测技术也存在不足：（1）多重PCR使用多对引物同时扩增时，可能出现引物间相互干扰，影响其敏感度和特异度，造成假阴性或假阳性；（2）核酸检测阳性结果需结合临床实际情况，分析究竟是定植菌还是致病菌。
目前，我国自主研发的环引物介导的等温扩增微流控芯片体系，有机结合了核酸分子扩增和基因芯片技术，应用加样后自动封闭式的独立分隔多重扩增，在提高诊断率的同时，降低和避免了常规核酸扩增引起污染的可能，现已广泛应用于临床病原的检测[58]。
（六）16SrRNA基因测序和宏基因组测序
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