作者基于Nanopore高通量测序平台
搭建了一套能够有效去除人体DNA干扰
且能在6h内快速检测下呼吸道感染病原的检测流程
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Nanoporemetagenomicsenablesrapidclinicaldiagnosisofbacteriallowerrespiratoryinfection
Nanopore宏基因组学临床快速诊断细菌性下呼吸道感染
作者:ThemoulaCharalampous,GemmaL.Kay,HollianRichrdson,etal.
作者:NatureBiotechnology
时间：.07
IF：31.
DOI：10./s---5
研究背景
呼吸道感染（RIs）病原的快速检测一直是医疗中亟待解决的问题。目前医疗中对RIs病原检测的方法主要依赖培养和敏感实验，这种方法耗时并且敏感度不高，对疾病治疗前期病原的快速确定和抗生素使用提供不了及时准确的指导，同时也会导致抗生素的滥用以及病人肠道微生物群落的紊乱。
随着高通量测序技术的发展，已有研究将其运用于临床RIs病原的快速检测，但RIs样本类型众多并且病原含量差别很大，同时带有大量的人体细胞，给这一运用推广带来了不小的难度。因此本文作者基于Nanopore高通量测序平台搭建了一套能够有效去除人体DNA（99.99%）干扰并且能在6h内快速检测下呼吸道感染（LRIs）病原的检测流程。
实验设计
作者从NNUH（UK）医院得到许可后共获得81例已经做过培养和抗性检测的呼吸道样本。样本按照预实验和优化实验分别包含40例和41例样本。预实验为34阳性样本、6NRF，共涉34痰液、4BAL和2ETAs；优化实验包括29例疑似感染样本，9NRF样本和3NSG样本，共涉38痰液，1个BAL和2ETAs样本。
LRIs检测流程中为了尽可能去除宿主DNA提高检测灵敏度，在优化实验的人体宿主细胞去除、微生物DNA提取和nanopore测序三个步骤里较预实验都做了对应的优化，比如宿主DNA去除时找到了合适浓度的saponin（2.2%），HL-SAN步骤由两步减为一步，清洗步骤缩减为2次，详情见图1。
图1nanopore宏基因组快检流程
所有样本提取得到合格的DNA后建MinION文库，预实验和优化实验分别取了48h完整测序和测序前2h的reads用于下游数据分析。测序reads通过mapping去除人体reads后于EPI2ME平台用WIMP对reads进行病原物种的注释（RefSeq），用ARMA进行抗性基因检测（CARDdatabase）。在本次检测中作者参照常规培养检测阈值（病原/mL样本）建立了基于测序的thresholds，对应病原物种reads≥1%时为阳性，抗性基因则是大于等于一个比对（alignment）。本次实验中也设计了对应的病原菌添加实验检测了优化方法的检测线（LoD）以及评价了基于qPCR检测的mock